ReadyPour 8% Bis Tris Solution是一種Acrylamide膠預(yù)混液，該預(yù)混液安全、快速、操作簡(jiǎn)單、解析度高
本品已預(yù)先配制成 8% 分離膠液體，按照百分之一的比例加入相應(yīng)量的 10%過硫酸銨或其替代物溶液
按照千分之一的比例加入相應(yīng)量的 TEMED。
例如 10ml 12% SDS-PAGE 分離膠預(yù)混液中，加入 100μl 10%過硫酸銨和 10μl TEMED
即可直接灌膠，能在10分鐘以內(nèi)完成凝膠（夏季3-5分鐘）
凝膠時(shí)間快，無須再自行配置並節(jié)省時(shí)間
注意：
1.APS和TEMED品質(zhì)的好壞會(huì)影響凝膠時(shí)間，請(qǐng)用新鮮配制的APS;
2.由于凝膠速度快,請(qǐng)勿比照傳統(tǒng)制膠方式采用槍頭轉(zhuǎn)移進(jìn)行灌膠;
3.灌入分離膠后記得取起制膠架輕輕拍敲桌面以利膠體鍵結(jié)緊實(shí);
4.分離膠與濃縮膠之間無須用水壓平,因此灌上層濃縮膠時(shí)不要在固定位點(diǎn)擠壓灌膠;
5.抽拔齒梳時(shí), 齒梳左右二邊一定要平,輕緩慢慢拔起;
操作方式:
1.在擠壓瓶中加入相應(yīng)比例TEMED和APS后即可進(jìn)行灌膠
(等同傳統(tǒng)計(jì)算方式:TEMED為配膠總體積的千分之一,APS為配膠總體積的百分之一)
2.取分離膠擠壓瓶在玻璃板中空縫隙中選擇一位點(diǎn)擠壓灌入制作分離膠,
3.然后將整座制膠架取起,輕輕拍敲桌面兩下即可
分離膠擠壓瓶中的剩余預(yù)混液凝結(jié)成果凍狀后,即代表已凝膠
用于制備SDS Page凝膠或WB實(shí)驗(yàn)?zāi)z
學(xué)習(xí)Western Blot技術(shù)，首先要學(xué)習(xí)的就是手灌膠技術(shù)。
手灌膠技術(shù)是WB實(shí)驗(yàn)中最基本的技術(shù)，雖然現(xiàn)在預(yù)制膠橫行天下
但是對(duì)于某些特定蛋白或比較極端分子量的蛋白，
預(yù)制膠達(dá)不到好的分離效果
有些表達(dá)量極低的蛋白預(yù)制膠膠孔達(dá)不到足夠上樣量
我們就需要根據(jù)待分離蛋白的特性來配制聚丙烯酰胺凝膠
傳統(tǒng)制膠及步驟繁瑣之處:
（1）手灌膠各成分介紹；
a.丙烯酰胺：形成聚丙烯酰胺的基本物質(zhì)，具有神經(jīng)毒性及致癌性（WB所用試劑幾乎都具有強(qiáng)毒性，做好實(shí)驗(yàn)的前提，先要保護(hù)好自己）；
b.Tris-Hcl:在蛋白電泳中與Gly構(gòu)成緩沖體系，穩(wěn)定電泳過程中的PH穩(wěn)定，Tris（氨丁三醇）可致癌；
c.過硫酸銨（AP）：相當(dāng)于催化劑作用，提供兩種丙烯酰胺聚合所必須的自由基；
d.TEMED（四甲基二乙胺）:催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)，促進(jìn)聚丙烯酰胺凝膠形成（凝固劑）,具有強(qiáng)烈刺激性氣味（惡臭），并具強(qiáng)神經(jīng)毒性；
e.SDS（十二烷基硫酸鈉）：能使蛋白變性，具有呼吸刺激性。
（2）常用分離膠濃度與最佳分離范圍；
| 分離膠濃度 |
最佳分離范圍（kD） |
| 6% |
50—150/60-220 |
| 8% |
30—90 |
| 10% |
20—80 |
| 12% |
12—60 |
| 15% |
10–40 |
備注：分離膠濃度越大，最佳分離蛋白分子量越小。
（3）分離膠配制(兩塊膠量—10ml)；
| 成分 |
分離膠濃度 |
| 6% |
8% |
10% |
12% |
15% |
| 超純水 |
5.3ml |
4.6ml |
4ml |
3.3ml |
2.3ml |
| 30%丙烯酰胺 |
2ml |
2.7ml |
3.3ml |
4ml |
5ml |
| 1.5M Tris（PH8.8） |
2.5ml |
2.5ml |
2.5ml |
2.5ml |
2.5ml |
| 10%SDS |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
| 10%AP |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
| TEMED |
4μl |
4μl |
4μl |
4μl |
4μl |
備注：我們所說的膠濃度，實(shí)際是指丙烯酰胺濃度。
（4）濃縮膠配制：
| 成分 |
4ml量 |
6ml量 |
| 超純水 |
2.7ml |
4.1ml |
| 30%丙烯酰胺 |
660μl |
1.0ml |
| 1.5M Tris（PH6.8） |
500μl |
750μl |
| 10%SDS |
40μl |
60μl |
| 10%AP |
40μl |
60μl |
| TEMED |
4μl |
6μl |
備注：濃縮膠一般使用2—3ml即可，濃度一般使用5%。
（5）聚丙烯酰胺凝膠配制：
a.檢漏，選取清洗干凈的模具玻璃，固定于膠固定器上，加入超純水，檢查模具是否漏液；
b.配制分離膠，按所需濃度配制分離膠，配制過程中最后加入TEMED，混勻后灌入模具，防止產(chǎn)生氣泡，并注意高度，最后輕輕加入超純水封口，使液面平整，凝固速度受室溫影響，溫度越高，凝固越快，冬天可放入孵箱中加速凝固；
c.待水和膠之間出現(xiàn)一道折線時(shí)，說明膠已凝固，此時(shí)，將水倒出，并用吸水紙吸干殘余水分；
d.濃縮膠配制，按需量配制濃縮膠，同樣最后加入TEMED，灌入分離膠上面，灌滿模具，排氣泡后插入所需梳子，待膠凝固。
膠一般提前一天配制，配制完成后，可泡到電泳液中，存放于4℃冰箱保存，第二天使用。
手灌膠技術(shù)是WB的基礎(chǔ)入門級(jí)技術(shù)，相對(duì)于昂貴的預(yù)制膠，手灌膠性價(jià)比更高，對(duì)某些蛋白分離效果更好。
系統(tǒng)的掌握WB技術(shù)，依賴于預(yù)制膠遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，預(yù)制膠雖然節(jié)省了配膠的時(shí)間，但還是有特殊蛋白需要手灌膠進(jìn)行分離。
采用快速凝膠 8% 下層分離膠預(yù)混液簡(jiǎn)易之處:
擠壓瓶中加入相應(yīng)比例TEMED和APS后(等同傳統(tǒng)計(jì)算方式),即可進(jìn)行灌膠,取分離膠擠壓瓶在玻璃板中空縫隙中選擇
一位點(diǎn)擠壓灌入制作分離膠,然后將整座制膠架取起,輕輕拍敲桌面兩下即可
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