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1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。
SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。(3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。

3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：
NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

用於質(zhì)粒提取

質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題分析:

• 一、未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低：

  
  

  1、大腸桿菌老化

  請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。 

  2、質(zhì)?？截悢?shù)低    

  由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

  3、菌體中無(wú)質(zhì)粒   

  有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。

  4、堿裂解不充分   

  使用過(guò)多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液I、II和III的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)，可加倍使用溶液I、II和III，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。

  5、溶液使用不當(dāng)  

  溶液II在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

  6、吸附柱過(guò)載  

  不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)?；蛩拗骶欠浅８叩目截悢?shù)或生長(zhǎng)率，則需調(diào)整LB培養(yǎng)液體積。

  7、質(zhì)粒未全部洗脫（尤其質(zhì)粒較大時(shí)）  

  洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。

  8、乙醇?xì)埩?nbsp; 

  漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。

  9、洗脫液加入位置不正確  

  洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。

  10、洗脫液不合適

  DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液 (2.5 mM Tris-HCl， pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.5-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，導(dǎo)致如果pH過(guò)低可能洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。

  11、洗脫體積太小 

  洗脫體積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

  12、洗脫時(shí)間過(guò)短  

  洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置一分鐘可達(dá)到較好的效果。

  二、質(zhì)粒純度不高：

  1、混有蛋白  

  不要使用過(guò)多菌體。溶液I、II和III處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。

  2、混有RNA 

  RNase A處理不徹底，請(qǐng)減少菌體用量或加入溶液III之后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液I已保存6個(gè)月以上，請(qǐng)?jiān)谌芤篒中添加RNase A。

  3、混有基因組DNA

  加入溶液II和III后應(yīng)溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液II后過(guò)于粘稠，無(wú)法溫和混勻，請(qǐng)減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，不要超過(guò)16 小時(shí)。

  4、Solution III溶液加入時(shí)間過(guò)長(zhǎng)  

  Solution III溶液加入后，放置時(shí)間不要太長(zhǎng)，否則有可能會(huì)產(chǎn)生小片段DNA污染。

  5、含大量核酸酶的宿主菌  

  宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過(guò)程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。

  6、裂解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)  

  加入溶液II后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘。菌體量合適時(shí)，裂解應(yīng)該在1分鐘之內(nèi)就可以完成。

  7、質(zhì)粒的二聚體、多聚體及復(fù)制中間體形式  

  
  

  質(zhì)粒復(fù)制過(guò)程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測(cè)出。